Izvođenje četiri testa amplifikacije nukleinskih kiselina za identifikaciju SARS-CoV-2 u Etiopiji

Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje karusel od tri slajda odjednom. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće za kretanje kroz tri slajda odjednom ili koristite klizače na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Od izbijanja koronavirusne bolesti (COVID-19) 2019. godine, širom svijeta su razvijeni mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT) koji su postali standardni testovi. Iako je nekoliko testova brzo razvijeno i primijenjeno u laboratorijskim dijagnostičkim testovima, njihova učinkovitost nije procijenjena u različitim okruženjima. Stoga je cilj ove studije bio procijeniti učinkovitost Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech testova koristeći kompozitni referentni standard (CRS). Studija je provedena u Etiopskom institutu za javno zdravstvo (EPHI) od 1. do 30. decembra 2020. godine. 164 nazofaringealna uzorka ekstrahirana su korištenjem QIAamp RNA mini kita i Abbott sistema za pripremu uzoraka DNA. Od 164 uzorka, 59,1% je bilo pozitivno, a 40,9% negativno na CRS. Pozitivan rezultat testa Sansure Biotech bio je značajno niži u poređenju sa CRS-om (p < 0,05). Pozitivan rezultat testa Sansure Biotech bio je značajno niži u poređenju sa CRS-om (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotech bili su znatno niže u odnosu na CRS (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotecha bili su značajno niži u poređenju sa CRS-om (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05)。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05)。 Kod Sansure Biotech je značajno manje pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05). Sansure Biotech je imao značajno manje pozitivnih rezultata u poređenju sa CRS-om (p < 0,05).Ukupna saglasnost četiri analize bila je 96,3–100% u poređenju sa CRS-om. Pored niske stope pozitivnosti Sansure Biotech testa, performanse četiri testa bile su gotovo uporedive. Kao takav, Sansure Biotech [samo za istraživanje (RUO)] test zahtijeva dodatnu validaciju za njegovu upotrebu u Etiopiji. Konačno, treba razmotriti dodatna istraživanja kako bi se procijenili testovi s odgovarajućim tvrdnjama proizvođača.
Laboratorijsko testiranje dio je Strateškog plana Svjetske zdravstvene organizacije (SZO) za spremnost i odgovor (SPRP) na koronavirusnu bolest 2019 (COVID-19). SZO savjetuje da zemlje trebaju izgraditi laboratorijske kapacitete kako bi poboljšale spremnost, pravilno upravljanje slučajevima, budnost i brz odgovor na izazove javnog zdravstva. To ukazuje na to da je uloga laboratorije ključna za karakterizaciju bolesti i epidemiologiju novih zaraznih agensa i kontrolu njihovog širenja.
Dijagnoza COVID-19 zahtijeva epidemiološke i medicinske informacije, lične simptome/znakove, te radiografske i laboratorijske podatke2. Od kada je prijavljena epidemija COVID-19 u Wuhanu, Kina, širom svijeta su razvijeni mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT). Lančana reakcija polimeraze s reverznom transkripcijom u stvarnom vremenu (rRT-PCR) koristi se kao rutinska i standardna metoda za laboratorijsku dijagnozu infekcije teškim akutnim respiratornim sindromom 2 (SARS-CoV-2)3. Molekularna detekcija SARS-CoV-2 obično se zasniva na genima N (gen nukleokapsidnog proteina), E (gen proteina omotača) i RdRp (gen RNK-zavisne RNK polimeraze) u ORF1a/b (gen otvorenog okvira za čitanje 1a/b) regiji identificiranoj iz virusnog genoma. Smatraju se glavnim konzerviranim regijama koje se nalaze u virusnim genomima za prepoznavanje virusa4. Među ovim genima, geni RdRp i E imaju visoku analitičku osjetljivost detekcije, dok gen N ima nisku analitičku osjetljivost5.
Performanse PCR testova mogu varirati ovisno o različitim faktorima kao što su: reagensi za ekstrakciju, reagensi za amplifikaciju/detekciju, metoda ekstrakcije, kvalitet PCR uređaja i drugih instrumenata. Od aprila 2020. godine, više od 48 različitih dijagnostičkih uređaja iz devet zemalja dobilo je Ovlaštenje za hitnu upotrebu (EUA) za dijagnostiku COVID-196. U Etiopiji se više od 14 platformi za PCR u realnom vremenu koristi za PCR detekciju SARS-CoV-2 u 26 javnozdravstvenih ustanova, uključujući ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. Pored toga, dostupni su različiti PCR testovi, kao što su Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test. Iako je rRT-PCR vrlo osjetljiv, neki pacijenti sa COVID-19 prijavljuju lažno negativne rezultate zbog nedovoljnog broja kopija virusne ribonukleinske kiseline (RNK) u uzorcima usljed nepravilnog prikupljanja, transporta, skladištenja i rukovanja, te laboratorijskog testiranja, uvjeta i postupaka osoblja8. Osim toga, pogrešno rukovanje uzorkom ili kontrolom, postavljanje praga ciklusa (Ct) i unakrsna reaktivnost s drugim patogenim nukleinskim kiselinama ili neaktivnom/rezidualnom SARS-CoV-2 RNK mogu dovesti do lažno pozitivnih rezultata u rRT-PCR9 testovima. Dakle, jasno je da PCR testovi zaista mogu identificirati nosioce genskih fragmenata, jer ne mogu ni razlikovati zaista aktivne virusne gene, tako da testovi mogu identificirati samo nosioce, a ne i pacijente10. Stoga je važno procijeniti dijagnostičke performanse korištenjem standardnih metoda u našem okruženju. Iako su mnogi NAAT reagensi dostupni u Etiopskom institutu za javno zdravstvo (EPHI) i širom zemlje, još uvijek nije objavljena komparativna evaluacija njihove učinkovitosti. Stoga je cilj ove studije bio procijeniti komparativnu učinkovitost komercijalno dostupnih kompleta za detekciju SARS-CoV-2 pomoću rRT-PCR-a korištenjem kliničkih uzoraka.
U ovu studiju je uključeno ukupno 164 učesnika sa sumnjom na COVID-19. Većina uzoraka je iz centara za liječenje (118/164 = 72%), dok je preostalih 46 (28%) učesnika bilo iz centara koji nisu liječeni. Među učesnicima koji nisu liječeni u centru, 15 (9,1%) je imalo klinički sumnjive slučajeve, a 31 (18,9%) je imalo kontakte potvrđenih slučajeva. Devedeset tri (56,7%) učesnika su bili muškarci, a prosječna (± SD) starost učesnika je bila 31,10 (± 11,82) godina.
U ovoj studiji određene su stope pozitivnih i negativnih rezultata četiri testa za COVID-19. Tako su stope pozitivnih rezultata Abbott SARS-CoV-2 testa, Daan Gene 2019-nCoV testa, SARS-CoV-2 BGI testa i Sansure Biotech 2019-nCoV testa bile 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5%, respektivno. Pozitivni i negativni rezultati kompozitnog referentnog standarda (CRS) bili su 97 (59,1%) i 67 (40,9%), respektivno (Tabela 1). U ovoj studiji, definicija CRS-a zasnivala se na pravilu „bilo kojeg pozitivnog“, pri čemu su od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji su dali isti rezultat smatrani zaista pozitivnim ili negativnim.
U ovoj studiji, pronašli smo negativnu procentualnu saglasnost (NPA) od 100% (95% CI 94,6–100) za sve analize u poređenju sa CRS. Analiza Sansure Biotechnology pokazala je minimalni PPA od 93,8% (95% CI 87,2-97,1), a analiza Daan Gene 2019-nCoV imala je ukupnu saglasnost od 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Nasuprot tome, ukupna saglasnost između SARS-CoV-2 BGI testa i Sansure Biotech 2019-nCoV testa bila je 98,8% odnosno 96,3% (Tabela 2).
Cohenov kappa koeficijent slaganja između rezultata CRS i Abbott SARS-CoV-2 testa bio je potpuno konzistentan (K = 1,00). Slično tome, Cohenove kappa vrijednosti detektovane pomoću Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV također su u potpunosti konzistentne sa CRS (K ≥ 0,925). U ovoj komparativnoj analizi, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je da su se rezultati Sansure Biotech 2019-nCoV testa značajno razlikovali od rezultata CRS (p = 0,031) (Tabela 2).
Kao što je prikazano na Sl.1. Procenat najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinovani RdRp i N gen) bio je 87,6%, a Ct vrijednost ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV testa pokazala je da je procenat niske Ct vrijednosti (< 20 Ct) bio 50,3%, a visoke Ct vrijednosti (36–40 Ct) 3,2%. 1. Procenat najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinovani RdRp i N gen) bio je 87,6%, a Ct vrijednost ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV testa pokazala je da je procenat niske Ct vrijednosti (< 20 Ct) bio 50,3%, a visoke Ct vrijednosti (36–40 Ct) 3,2%.Kao što je prikazano na Sl.1, procenat naimenzionisanih vrednosti Ct (< 20 Ct) analize Abbott SARS-CoV-2 (kombinovani gen RdRp i N) iznosio je 87,6%, a vrijednost Ct gena ORF1a/b analiza Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je procentualno niske vrijednosti vrijednosti Ct (< 20 Ct) visoke vrijednosti, 3 %, Ct. (36–40 Ct) sostavlâlo 3,2%. 1, procenat najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) analize Abbott SARS-CoV-2 (kombinovani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a analiza Ct vrijednosti ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je da procenat niske Ct vrijednosti (< 20 Ct) čini 50,3%, a visoke Ct vrijednosti (36–40 Ct) 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测 (结合RdRp 和N 基因)）的最低Ct 值百分比% (70 Ct Biotech)（< 20 Ct Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36)的百分比为3,2%. Kao što je prikazano na Slici 1, najniži postotak Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinacija RdRp i N gena) iznosi 87,6%, vrijednost Ct ORF1a/b gena Sansure Biotech 2019-nCoV testa pokazuje nizak postotak Ct (< 20 Ct) od 50,3%, a postotak 高Ct (36–40 Ct) od 3,2%. Kao što je prikazano na crtežu 1, analiza Abbott SARS-CoV-2 (sočetajući gen RdRp i N) ima nisku procentualnu vrijednost Ct (< 20 Ct) u veličini od 87,6%, a vrijednost Ct gena ORF1a/b u istraživanju Sansure Biotech 2019- Analiza nCoV pokazala je nizak Ct. Kao što je prikazano na Slici 1, Abbott SARS-CoV-2 test (kombinujući gene RdRp i N) imao je najniži postotak Ct vrijednosti (< 20 Ct) od 87,6%, dok je Ct vrijednost gena ORF1a/b u studiji Sansure Biotech 2019 – Analiza nCoV pokazala nizak Ct. Procenat vrednosti (< 20 Ct) iznosio je 50,3%, a procenat visokih vrednosti Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%. Procenat vrijednosti (< 20 Ct) bio je 50,3%, a procenat visokih Ct vrijednosti (36–40 Ct) bio je 3,2%.Abbott SARS-CoV-2 B test je zabilježio Ct vrijednosti iznad 30. S druge strane, na BGI SARS-CoV-2 testu, gen ORF1a/b imao je visoku Ct vrijednost (> 36 Ct), a postotak je bio 4% (Slika 1). S druge strane, na BGI SARS-CoV-2 testu, gen ORF1a/b imao je visoku Ct vrijednost (> 36 Ct), a postotak je bio 4% (Slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gena ORF1a/b ima visoku vrijednost Ct (> 36 Ct), postotak kojeg čini 4% (ris. 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b imao je visoku Ct vrijednost (> 36 Ct), čiji je postotak iznosio 4% (Slika 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中,ORF1a/b 基因具有高Ct 值 (> 36 Ct)）的百分%比丛〼 S druge strane, u detekciji SARS-CoV-2 pomoću BGI, postotak ORF1a/b gena s visokom Ct vrijednošću (>36 Ct) iznosi 4% (Slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 procenta gena ORF1a/b s visokim vrijednostima Ct (>36 Ct) iznosio je 4% (ris. 1). S druge strane, u BGI SARS-CoV-2 analizi, postotak ORF1a/b gena s visokim Ct vrijednostima ​​(>36 Ct) bio je 4% (Slika 1).
U ovoj studiji uzeli smo 164 nazofaringealna uzorka. Za sve vrste testova, izolacija i amplifikacija RNK izvršena je korištenjem metoda i kitova koje preporučuju odgovarajući proizvođači.
Ova studija je pokazala da Abbottov test za SARS-CoV-2 ima iste performanse detekcije kao i CRS, sa 100% pozitivnih, negativnih i ukupnih rezultata. Cohenova kappa podudarnost je 1,00, što ukazuje na potpuno slaganje sa CRS. Slična studija Univerziteta u Washingtonu u SAD-u otkrila je da je ukupna osjetljivost i specifičnost Abbottovog testa za SARS-CoV-2 bila 93% odnosno 100%, u poređenju sa laboratorijski određenim testom (LDA) CDC-a. 11. Abbottov sistem za detekciju SARS-CoV-2 zasniva se na istovremenoj kombinovanoj detekciji gena N i RdRp, jer su oba gena osjetljivija, minimizirajući lažno negativne rezultate12. Studija u Beču, Austrija, također je pokazala da veliki volumeni uzorka ekstrakcije i volumeni eluenta za detekciju minimiziraju efekte razrjeđivanja i povećavaju efikasnost detekcije13. Dakle, Abbottovo savršeno podudaranje za SARS-CoV-2 test može se povezati sa sistemom za detekciju platforme koji istovremeno detektuje kombinatorne gene, ekstrahuje veliki broj uzoraka (0,5 ml) i koristi veliku količinu eluenta (40 µl).
Naši rezultati su također pokazali da je detekcijska učinkovitost Daan genetskog testa bila gotovo ista kao i kod CRS-a. Ovo je u skladu sa studijom14 provedenom na Univerzitetu Anhui u Huainanu, Kina, i tvrdnjom proizvođača o 100% pozitivnom slaganju. Uprkos izvještajima o konzistentnim rezultatima, jedan uzorak je bio lažno negativan nakon ponovnog testiranja istog eluata, ali je bio pozitivan u Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019 testovima. Ovo ukazuje na mogućnost varijabilnosti u rezultatima kod različitih vrsta testova. Ipak, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat Daan Gene testa bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s njihovim laboratorijski definiranim referentnim testom. Ipak, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat Daan Gene testa bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u usporedbi s njihovim laboratorijski definiranim referentnim testom. Ovo nije manje, u istraživanju, sprovedenom u Kitae15, rezultat analize Daan Genea značajno se razlikuje (p < 0,05) od njihove laboratorijske etalonske analize. Međutim, u studiji provedenoj u Kini15, rezultat analize Daan Genea značajno se razlikovao (p < 0,05) od njihove referentne laboratorijske analize.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Međutim, u istraživanju, sprovedenom u Kitae15, rezultati genetičkog testa Daan značajno su se razlikovali (p < 0,05) u odnosu na njegov etalonski laboratorijski test. Međutim, u studiji provedenoj u Kini15, rezultati Daanovog genetskog testa bili su značajno drugačiji (p < 0,05) u poređenju s testom iz referentne laboratorije.Ova razlika može biti posljedica osjetljivosti referentnog testa za detekciju SARS-CoV-2, a daljnja istraživanja mogu biti važna za utvrđivanje uzroka.
Pored toga, naša studija je procijenila komparativne performanse SARS-CoV-2 BGI testa sa CRS, pokazujući odličan pozitivni postotak slaganja (PPA = 97,9%), negativni postotak slaganja (NPA = 100%) i ukupni postotak slaganja po spolu (OPA). = 98,8%). Cohenove Kappa vrijednosti ​​pokazale su dobro slaganje (K = 0,975). Studije u Holandiji16 i Kini15 pokazale su konzistentne rezultate. SARS-CoV-2 BGI test je test detekcije jednog gena (ORF1a/b) koji koristi 10 µl amplifikacijskog/detekcionog eluata. Uprkos dobrom statističkom slaganju s našim referentnim rezultatima, analiza je propustila dva pozitivna uzorka (1,22%) od ukupnog uzorka. Ovo može imati ogromne kliničke implikacije na dinamiku prenosa i na nivou pacijenta i na nivou zajednice.
Druga komparativna analiza uključena u ovu studiju bio je Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) test; ukupni postotak podudaranja bio je 96,3%. Jačina slaganja također je određena Cohenovom Kappa vrijednošću, koja je iznosila 0,925, što ukazuje na potpuno slaganje sa CRS-om. Ponovo, naši rezultati su identični studijama provedenim na Central South University u Changsha, Kina, i na Odjelu za kliničku laboratoriju Narodne bolnice Liuzhou, grad Liuzhou, Kina17. Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemar test) pokazao je da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u odnosu na CRS (p < 0,005). Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemar test) pokazao je da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u odnosu na CRS (p < 0,005). Bez obzira na to, što je zafiksirano ukazano na više visoke statističke ocene, kriterijum hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je rezultat analize Sansure Biotech ima statistički značajne razlike u odnosu na CRS (p < 0,005). Iako je zabilježena dobra statistička saglasnost iznad, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u poređenju sa CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验 (MacNemar 检验)）表明, Sansure Biotech, CR相比具有统计学显着差异 (p < 0,005)。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， san biotech与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。) Bez obzira na više odmerene statističke ocene, kriterijum hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između analize Sansure Biotech i CRS. Uprkos dobrom statističkom slaganju navedenom gore, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između Sansure Biotech testa i CRS-a.Šest uzoraka (3,66%) utvrđeno je kao lažno negativni u poređenju sa CRS-om (Dodatna tabela 1); ovo je veoma važno, posebno s obzirom na dinamiku prenosa virusa. Gore navedeni podaci takođe podržavaju ovu nisku stopu detekcije15.
U ovoj studiji, Ct vrijednosti su određene za svaki test i odgovarajuću platformu, s najnižom prosječnom Ct vrijednošću prijavljenom u Abbott SARS-CoV-2 testu. Ovaj rezultat može biti povezan s Abbott-ovim simultanim kombinovanim genetskim sistemom testiranja za detekciju SARS-CoV-2. Stoga, prema Slici 1, 87,6% Abbott SARS-CoV-2 rezultata imalo je Ct vrijednosti ispod 20. Samo mali broj rezultata uzoraka (12,4%) bio je u rasponu od 20-30. Ct vrijednosti iznad 30 nisu zabilježene. Pored Abbott-ove upotrebe formata genetskog testiranja panela SARS-CoV-2, ovaj rezultat može biti povezan s donjom granicom detekcije (32,5 RNK kopija/mL)18, što je tri puta niže od donje granice kompanije od 100 RNK kopija/mL)19.
Ova studija ima neka ograničenja: prvo, nemamo standardne/referentne metode [kao što su virusno opterećenje ili drugi laboratorijski testovi (LDA)] zbog nedostatka resursa. Drugo, svi uzorci korišteni u ovoj studiji bili su nazofaringealni brisevi, dok rezultati nisu bili primjenjivi na druge vrste uzoraka, i treće, veličina našeg uzorka je bila mala.
Ova studija je uporedila performanse četiri rRT-PCR testa za SARS-CoV-2 korištenjem nazofaringealnih uzoraka. Svi testovi detekcije imali su gotovo uporedive performanse, s izuzetkom Sansure Biotech testa. Osim toga, u Sansure Biotech testu je utvrđena niska stopa pozitivnosti u poređenju sa CRS testom (p < 0,05). Osim toga, u Sansure Biotech testu je utvrđena niska stopa pozitivnosti u poređenju sa CRS testom (p < 0,05). Osim toga, u testu Sansure Biotech pokazao je nizak postotak pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test je pokazao nizak postotak pozitivnih rezultata u poređenju sa CRS-om (p < 0,05).此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Osim toga, analiza Sansure Biotech-a ima više niskih nivoa pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test je imao nižu stopu pozitivnosti u poređenju sa CRS-om (p < 0,05).Analiza PPA, NPA i ukupne saglasnosti koju je provela kompanija Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) premašila je 93,5% sa vrijednošću Cohen Kappa jačine saglasnosti od 0,925. Konačno, Sansure Biotech test (RUO) zahtijeva daljnju validaciju za upotrebu u Etiopiji, a trebalo bi razmotriti i dodatna istraživanja kako bi se procijenile tvrdnje pojedinačnih proizvođača.
Komparativna studija je provedena u četiri zdravstvene ustanove u Addis Abebi: bolnici Eka Kotebe, centru za liječenje crkve Millennium, memorijalnoj bolnici Zewooditu i specijalističkoj bolnici za tuberkulozu St. Peter's. Podaci su prikupljeni između 1. i 31. decembra 2020. godine. Medicinske ustanove za ovu studiju su namjerno odabrane na osnovu velikog broja slučajeva i dostupnosti glavnih centara za liječenje u gradu. Slično tome, instrumenti, uključujući instrumente za PCR u realnom vremenu ABI 7500 i Abbott m2000, odabrani su prema preporukama proizvođača NAAT reagensa, a za ovu studiju su odabrana četiri PCR detekcijska kompleta, budući da je većina laboratorija u Etiopiji koristila najmanje četiri od njih. Tokom studije provedeni su genski test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test.
Testiranje na SARS-CoV-2 provedeno je od 1. do 30. decembra 2020. godine korištenjem 3 ml virusnog transportnog medija (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) od osoba koje su pod istragom na COVID-19 i upućene su u EPHI. Uzorke nazofarinksa prikupili su obučeni sakupljači uzoraka i poslali u EPHI u trostrukim pakovanjima. Prije izolacije nukleinske kiseline, svakom uzorku se dodjeljuje jedinstveni identifikacijski broj. Ekstrakcija se vrši iz svakog uzorka odmah po dolasku korištenjem ručnih i automatskih metoda ekstrakcije. Dakle, za automatsku ekstrakciju Abbott m2000, 1,3 ml (uključujući 0,8 ml mrtvog volumena i 0,5 ml ulaznog volumena ekstrakcije) uzorka je ekstrahirano iz svakog uzorka i propušteno kroz Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, SAD). Serija od 96 [92 uzorka, dvije kontrole detekcije i dvije kontrole bez predloška (NTC)] uključena je u cjelokupni proces (preuzimanje i detekcija) dva kruga SARS-CoV-2 (EUA) u realnom vremenu. rudarenje u realnom vremenu. Slično tome, za ručnu ekstrakciju koristite iste uzorke (za automatsku ekstrakciju i otkrivanje). Dakle, tokom cijelog procesa, 140 µl uzoraka je alikvotirano i ekstrahirano korištenjem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Njemačka) u serijama od 24 (uključujući 20 uzoraka, dvije kontrole testa i dva NTC-a) tokom devet rundi. Ručno ekstrahirani eluati su amplificirani i detektirani korištenjem ABI 7500 termalnog ciklera koristeći SARS-CoV-2 BGI test, Daan Gene test i Sansure Biotech test.
Automatska izolacija i prečišćavanje virusne RNK SARS-CoV-2 slijedi princip magnetskih kuglica korištenjem Abbott reagensa za pripremu uzoraka DNK. Inaktivacija uzoraka i solubilizacija virusnih čestica provodi se korištenjem deterdženta koji sadrži gvanidin izotiocijanat za denaturaciju proteina i inaktivaciju RNaze. RNK se zatim odvaja od proteina separacijom na čvrstoj fazi korištenjem silicijum dioksida, tj. gvanidinijum sol i alkalni pH pufera za lizu potiču vezivanje nukleinskih kiselina za silicijum dioksid (SiO2). Korak ispiranja uklanja preostale proteine ​​i ostatke kako bi se dobio bistri rastvor. Transparentna RNK se izoluje iz mikročestica na bazi silicijum dioksida korištenjem magnetskog polja instrumenta20,21. S druge strane, ručna izolacija i prečišćavanje RNK provodi se metodom spin kolone korištenjem centrifugiranja umjesto magnetskog stalka i odvajanja mikročestica od eluenta.
Abbott test detekcije SARS-CoV-2 u realnom vremenu (Abbott Molecular, Inc.) proveden je prema uputama proizvođača, koji je dobio EUA19,22 od WHO i FDA. U ovom protokolu, inaktivacija uzorka prije ekstrakcije izvršena je u vodenom kupatilu na 56 °C tokom 30 minuta. Nakon inaktivacije virusa, ekstrakcija nukleinske kiseline izvršena je na Abbott m2000 SP instrumentu iz 0,5 ml VTM-a korištenjem Abbott m2000 sistema za pripremu uzoraka DNK, prema uputama proizvođača. Amplifikacija i detekcija izvršene su korištenjem Abbott m2000 RT-PCR instrumenta, a dvostruka detekcija izvršena je za gene RdRp i N. Za ciljanje i detekciju internih kontrola korišteni su ROX) i VIC P (vlasnička boja) za ciljanje i detekciju internih kontrola, što omogućava istovremenu detekciju oba produkta amplifikacije 19.
Metoda detekcije amplifikacije ovog kompleta zasniva se na RT-PCR tehnologiji u jednom koraku. Geni ORF1a/b i N odabrani su kao konzervirane regije od strane Daan Gene Technology za detekciju amplifikacije ciljne regije. Specifični prajmeri i fluorescentne probe (probe N gena označene sa FAM, probe ORF1a/b označene sa VIC) dizajnirani su za detekciju SARS-CoV-2 RNK u uzorcima. Konačni eluent i master miksovi pripremljeni su dodavanjem 5 µl eluenta u 20 µl master miksa do konačne zapremine od 25 µl. Amplifikacija i detekcija su izvedene istovremeno na ABI 750024 instrumentu za PCR u realnom vremenu.
ORF1a/b i N geni su detektovani korištenjem Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit-a (fluorescentna PCR detekcija). Pripremite specifične probe za svaki ciljni gen odabirom FAM kanala za ORF1a/b regiju i ROX kanala za N gen. U ovaj testni kit, eluent i master mix reagensi se dodaju na sljedeći način: pripremite 30 µl master mix reagensa i 20 µl eluiranog uzorka za detekciju/amplifikaciju. Za amplifikaciju/detekciju je korišten Real-time PCR ABI 750025.
SARS-CoV-2 BGI test je fluorescentni real-time rRT-PCR kit za dijagnozu COVID-19. Ciljna regija se nalazi u ORF1a/b regiji genoma SARS-CoV-2, što je metoda detekcije jednog gena. Osim toga, ljudski domaći gen β-aktin je interno regulirani ciljni gen. Master mix se priprema miješanjem 20 µl master mix reagensa i 10 µl ekstrahiranog uzorka RNK u ploči s jažicama26. Za amplifikaciju i detekciju korišten je ABI 7500 fluorescentni kvantitativni real-time PCR instrument. Sva amplifikacija nukleinskih kiselina, uslovi PCR-a za svaki test i interpretacija rezultata izvršeni su prema odgovarajućim uputama proizvođača (Tabela 3).
U ovoj komparativnoj analizi nismo koristili metodu referentnog standarda za određivanje procenta slaganja (pozitivno, negativno i ukupno) i drugih parametara poređenja za četiri analize. Svako poređenje testova urađeno je sa CRS-om, u ovoj studiji CRS je postavljen prema pravilu "bilo koji pozitivan" i rezultat je određen, a ne jednim testom, koristili smo najmanje dva uparena rezultata testa. Osim toga, u slučaju prenosa COVID-19, lažno negativni rezultati su opasniji od lažno pozitivnih rezultata. Stoga, da bi se što preciznije reklo "pozitivno" iz rezultata CRS-a, najmanje dva testa moraju biti pozitivna, što znači da je vjerovatno da će najmanje jedan pozitivan rezultat doći iz EUA testa. Dakle, od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji daju isti rezultat smatraju se zaista pozitivnim ili negativnim18,27.
Podaci su prikupljeni korištenjem strukturiranih obrazaca za ekstrakciju podataka, unos podataka i analiza izvršeni su korištenjem statističkog softvera Excel i SPSS verzije 23.0 za deskriptivnu statistiku. Analizirani su pozitivni, negativni i ukupni postotak slaganja, a Kappa skor je korišten za određivanje stepena slaganja svake metode sa CRS-om. Kappa vrijednosti se tumače na sljedeći način: 0,01 do 0,20 za blago slaganje, 0,21 do 0,40 za opće slaganje, 0,41-0,60 za umjereno slaganje, 0,61-0,80 za značajno slaganje i 0,81-0,99 za potpuno slaganje28.
Etičko odobrenje dobijeno je od Univerziteta u Adis Abebi, a sve eksperimentalne protokole za ovu studiju odobrio je Odbor za naučnu etiku Etiopskog instituta za javno zdravstvo. Referentni broj za etičku licencu EPHI je EPHI/IRB-279-2020. Sve metode su primijenjene u skladu s preporukama i odredbama Etiopskih nacionalnih sveobuhvatnih smjernica za liječenje COVID-19. Pored toga, pismeni informirani pristanak dobijen je od svih učesnika studije prije učešća u studiji.
Svi podaci dobijeni ili analizirani u ovoj studiji uključeni su u ovaj objavljeni članak. Podaci koji podržavaju rezultate ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Svjetska zdravstvena organizacija. Preporuke za strategije laboratorijskog testiranja za COVID-19: Privremene smjernice, 21. mart 2020. br. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Sve u praksi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Sve u praksi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: sve u praksi.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u odjeljenjima hitne pomoći: integracija od početka do kraja u praksi. Stručnjak Reverend Respire. medicina. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL i St George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa. Mitchell, SL i St George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell, SL i St. George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell SL i St. George K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
SZO. Laboratorijsko otkrivanje koronavirusne bolesti 2019 (COVID-19) kod ljudi za koje se sumnja da su oboljeli. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (pristupljeno 15. augusta 2020.) (SZO, 2020).
Udugama, B. i dr. Dijagnoza COVID-19: Bolesti i alati za testiranje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. i dr. Osnivanje Koledža patologa istočne, centralne i južne Afrike – Regionalne škole za patologiju Bliskog istoka i Južne Afrike. Afrika. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopski institut za javno zdravstvo, Federalno ministarstvo zdravstva. Privremena nacionalna strategija i smjernice za laboratorijsku dijagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (pristupljeno 12. augusta 2020.) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Lažno negativni testovi za infekciju SARS-CoV-2, izazovi i implikacije. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Lažno negativni testovi za infekciju SARS-CoV-2, izazovi i implikacije.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi za SARS-CoV-2 infekcije i njihove posljedice.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi za provokaciju i utjecaj SARS-CoV-2 infekcije. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Strategije respiratorne prevencije i upravljanja, vakcinacija i daljnje perspektive. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Strategije respiratorne prevencije i upravljanja, vakcinacija i daljnje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ložno-pozitivne i ložno-otporne slučajeve COVID-19: respiratorna prevencija i strategije liječenja, vakcinacija i daljnje perspektive. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: strategije respiratorne prevencije i liječenja, vakcinacija i put naprijed.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: strategije za respiratornu prevenciju i liječenje, vakcinacija i put naprijed. Stručnjak Reverend Respire. medicina. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Vidjeti drvo, ali izgubiti šumu. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Vidjeti drvo, ali izgubiti šumu.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Vidite drvo, izgubite šumu.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Dijagnoza COVID-19 u hitnim službama: Nema dovoljno šume za drveće. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. i dr. Validacija i validacija analitičkih i kliničkih performansi Abbott RealTime SARS-CoV-2 testa. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Poređenje pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Poređenje pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Poređenje pet setova primera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Poređenje 5 različitih genetskih regija COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Poređenje pet setova prajmera iz različitih regija genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnom RT-PCR metodom.Iran. Časopis za mikrobiologiju. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. i dr. Preliminarni rezultati nacionalnog programa eksterne procjene kvalitete za detekciju genomskih sekvenci SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. i dr. Analitička evaluacija efikasnosti pet RT-PCR kompleta za teški akutni respiratorni sindrom uzrokovan koronavirusom 2. J. Clinical. laboratory. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. i dr. Evaluacija sedam komercijalno dostupnih kompleta za detekciju RNK SARS-CoV-2 u Kini na osnovu lančane reakcije polimeraze (PCR) u realnom vremenu. klinička. hemijska. laboratorijska. medicina. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB i dr. Poređenje sedam komercijalnih RT-PCR dijagnostičkih kompleta za COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu i dr. Poređenje dijagnostičkih performansi dva PCR kita za detekciju nukleinskih kiselina SARS-CoV-2. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, itd. Komparativna studija četiri platforme za testiranje amplifikacije nukleinskih kiselina (NAAT) SARS-CoV-2 pokazala je da su performanse ID NOW značajno smanjene ovisno o pacijentu i vrsti uzorka. dijagnoza. mikrobiologija. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott molekula. Abbott uputstvo za analizu SARS-CoV-2 u realnom vremenu. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Zaključno sa 10. augustom 2020.) (2020).
Klein, S. i dr. Izolacija RNK SARS-CoV-2 korištenjem magnetskih kuglica za brzu detekciju velikih razmjera putem RT-qPCR i RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).