Izvođenje četiri testa amplifikacije nukleinske kiseline za identifikaciju SARS-CoV-2 u Etiopiji

Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak od tri slajda odjednom. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće da se krećete kroz tri slajda odjednom ili koristite dugmad klizača na kraju da se krećete kroz tri slajda odjednom.
Od izbijanja bolesti korona virusa (COVID-19) 2019. godine, mnogi komercijalni testovi amplifikacije nukleinske kiseline (NAAT) razvijeni su širom svijeta i postali su standardni testovi. Iako je nekoliko testova brzo razvijeno i primijenjeno na laboratorijske dijagnostičke testove, učinak ovih testova nije evaluiran u različitim okruženjima. Stoga je ova studija imala za cilj procijeniti učinak Abbott testova SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech koristeći Composite Reference Standard (CRS). Studija je sprovedena na Etiopskom institutu za javno zdravlje (EPHI) od 1. do 30. decembra 2020. 164 nazofaringealna uzorka ekstrahovana su pomoću QIAamp RNA mini kita i Abbott sistema za pripremu uzoraka DNK. Od 164 uzorka, 59,1% je bilo pozitivno, a 40,9% negativno na CRS. Sansure Biotech pozitivnost je bila značajno niska u poređenju sa CRS (p < 0,05). Sansure Biotech pozitivnost je bila značajno niska u poređenju sa CRS (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotech bili su znatno niže u odnosu na CRS (p < 0,05). Pozitivni rezultati Sansure Biotech-a bili su značajno niži u odnosu na CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05)。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05)。 Kod Sansure Biotech je značajno manje pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05). Sansure Biotech je imao značajno manje pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05).Ukupna saglasnost četiri analize bila je 96,3–100% u poređenju sa CRS. Pored niske stope pozitivnosti Sansure Biotech testa, učinak četiri testa bio je skoro uporediv. Kao takav, Sansure Biotech [Research Only (RUO)] test zahtijeva dodatnu validaciju za njegovu upotrebu u Etiopiji. Konačno, potrebno je razmotriti dodatna istraživanja kako bi se ocijenili testovi s odgovarajućim tvrdnjama proizvođača.
Laboratorijsko testiranje dio je Strateškog plana Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) za spremnost i odgovor na bolest od korona virusa 2019 (COVID-19) (SPRP). SZO savjetuje da zemlje treba da izgrade laboratorijske kapacitete kako bi poboljšale spremnost, pravilno upravljanje slučajevima, budnost i brz odgovor na izazove javnog zdravlja. Ovo sugerira da je uloga laboratorija ključna za karakterizaciju bolesti i epidemiologije novih infektivnih agenasa i kontrolu njihovog širenja.
Dijagnoza COVID-19 zahtijeva epidemiološke i medicinske informacije, lične simptome/znakove, te radiografske i laboratorijske podatke2. Otkako je izbijanje COVID-19 prijavljeno u Wuhanu u Kini, širom svijeta su razvijeni mnogi komercijalni testovi za amplifikaciju nukleinske kiseline (NAAT). Lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije u realnom vremenu (rRT-PCR) koristi se kao rutinska i standardna metoda za laboratorijsku dijagnozu infekcije teškog akutnog respiratornog sindroma 2 (SARS-CoV-2)3. Molekularna detekcija SARS-CoV-2 se obično zasniva na genima N (gen za nukleokapsidni protein), E (gen za protein omotača) i RdRp (gen za RNA-zavisnu RNA polimerazu) u ORF1a/b (otvoreni okvir čitanja 1a/b) . gen) region identifikovan iz virusnog genoma. Smatra se da su oni glavni očuvani regioni pronađeni u virusnim genomima za prepoznavanje virusa4. Među ovim genima, RdRp i E geni imaju visoku analitičku detekcijsku osjetljivost, dok N gen ima nisku analitičku osjetljivost5.
Performanse PCR testova mogu varirati u zavisnosti od različitih faktora kao što su: reagensi za ekstrakciju, reagensi za amplifikaciju/detekciju, metod ekstrakcije, kvalitet PCR mašine i drugih instrumenata. Od aprila 2020. godine, više od 48 različitih dijagnostičkih uređaja iz devet zemalja dobilo je odobrenje za hitnu upotrebu (EUA) za dijagnostiku COVID-196. U Etiopiji se više od 14 PCR platformi u realnom vremenu koristi za PCR detekciju SARS-CoV-2 u 26 javnih zdravstvenih ustanova, uključujući ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. Osim toga, dostupni su različiti PCR testovi, kao što su Daan Gene test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test. Iako je rRT-PCR vrlo osjetljiv, neki pacijenti s COVID-19 prijavljuju lažno negativne rezultate zbog nedovoljnih kopija virusne ribonukleinske kiseline (RNA) u uzorcima zbog nepravilnog prikupljanja, transporta, skladištenja i rukovanja, te laboratorijskog testiranja. uslovi i radnje osoblja8. Osim toga, pogrešno rukovanje uzorkom ili kontrolom, postavljanje praga ciklusa (Ct) i unakrsna reaktivnost s drugim patogenim nukleinskim kiselinama ili neaktivnom/rezidualnom SARS-CoV-2 RNK mogu dovesti do lažno pozitivnih rezultata u rRT-PCR9 testovima. Dakle, jasno je da PCR testovi zaista mogu identificirati nosioce fragmenata gena, jer ne mogu čak ni razlikovati istinski aktivne virusne gene, tako da testovi mogu identificirati samo nosioce, a ne pacijente10. Stoga je važno procijeniti dijagnostičke performanse koristeći standardne metode u našem okruženju. Iako su mnogi NAAT reagensi dostupni u Etiopskom institutu za javno zdravlje (EPHI) iu cijeloj zemlji, još uvijek nije objavljena komparativna procjena njihove djelotvornosti. Stoga je ova studija imala za cilj procijeniti uporedni učinak komercijalno dostupnih kompleta za otkrivanje SARS-CoV-2 pomoću rRT-PCR-a koristeći kliničke uzorke.
Ukupno 164 učesnika sa sumnjom na COVID-19 uključeno je u ovu studiju. Većina uzoraka bila je iz centara za lečenje (118/164 = 72%), dok je preostalih 46 (28%) učesnika bilo iz centara koji nisu za lečenje. Među učesnicima koji nisu liječeni u centru, 15 (9,1%) je imalo klinički sumnjive slučajeve, a 31 (18,9%) je imalo kontakte s potvrđenim slučajevima. Devedeset i tri (56,7%) učesnika su bili muškarci, a srednja (± SD) starost učesnika bila je 31,10 (± 11,82) godina.
U ovoj studiji utvrđene su pozitivne i negativne stope četiri testa na COVID-19. Dakle, pozitivne stope Abbott testa SARS-CoV-2, testa Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI testa i Sansure Biotech 2019-nCoV testa bile su 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5% respektivno. . Pozitivni i negativni rezultati kompozitnog referentnog standarda (CRS) bili su 97 (59,1%) i 67 (40,9%), respektivno (Tabela 1). U ovoj studiji, definicija CRS-a je zasnovana na pravilu „bilo koji pozitivan“, pri čemu se od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji su dali isti rezultat smatraju istinito pozitivnim ili negativnim.
U ovoj studiji smo pronašli negativan postotak slaganja (NPA) od 100% (95% CI 94,6–100) za sve analize u poređenju sa CRS. Analiza Sansure Biotechnology pokazala je minimalni PPA od 93,8% (95% CI 87,2-97,1), a analiza Daan Gene 2019-nCoV imala je ukupno slaganje od 99,4% (95% CI 96,6-99,9). Nasuprot tome, ukupna saglasnost između SARS-CoV-2 BGI testa i Sansure Biotech 2019-nCoV testa iznosila je 98,8% odnosno 96,3% (tabela 2).
Cohenov kapa koeficijent slaganja između rezultata CRS-a i Abbott testa SARS-CoV-2 bio je potpuno konzistentan (K = 1,00). Slično tome, Cohenove kapa vrijednosti koje su otkrili Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV također su u potpunosti u skladu s CRS (K ≥ 0,925). U ovoj komparativnoj analizi, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je da se rezultati Sansure Biotech 2019-nCoV testa značajno razlikuju od rezultata CRS (p = 0,031) (Tablica 2).
Kao što je prikazano na sl.1 postotak najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott testa SARS-CoV-2 (kombinovani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a Ct vrijednost gena ORF1a/b za Sansure Biotech 2019-nCoV test je pokazao da je postotak niske vrijednosti Ct vrijednost (< 20 Ct) bila je 50,3% i visoka vrijednost Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%. 1 postotak najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott testa SARS-CoV-2 (kombinovani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a Ct vrijednost gena ORF1a/b za Sansure Biotech 2019-nCoV test je pokazao da je postotak niske vrijednosti Ct vrijednost (< 20 Ct) bila je 50,3% i visoka vrijednost Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%.Kao što je prikazano na sl.1, procenat naimenzionisanja Ct (< 20 Ct) analiza Abbott SARS-CoV-2 (kombinovani gen RdRp i N) iznosio je 87,6%, a vrijednost Ct gena ORF1a/b analiza Sansure Biotech 2019-nCoV pokazala je procenat niskih vrijednosti Ct (< 20 Ct) je bio 50,3%, a visoka vrijednost Ct (36–40 Ct) sostavlâlo 3,2%. 1, postotak najniže Ct vrijednosti (< 20 Ct) analize Abbott SARS-CoV-2 (kombinovani gen RdRp i N) bio je 87,6%, a Ct vrijednost ORF1a/b genske analize Sansure Biotech 2019-nCoV je pokazala da je postotak niske vrijednosti Ct (< 20 Ct) iznosio 50,3%, a visoke vrijednosti Ct (36–40 Ct) čini 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测 (结合RdRp 和N 基因)）的最低Ct 值百分比% (70 Ct Biotech)（< 20 Ct Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36)的百分比为3,2%. Kao što je prikazano na slici 1, najniži postotak Ct vrijednosti (< 20 Ct) Abbott SARS-CoV-2 testa (kombinacija RdRp i N gena) je 87,6%, vrijednost Ct gena ORF1a/b u Sansure Biotech 2019-nCoV testu pokazuje nizak Ct值(< 20 Ct) 的 postotak je 50,3%, 高Ct Procenat 值(36–40 Ct) 的 je 3,2%. Kao što je prikazano na crtežu 1, analiza Abbott SARS-CoV-2 (sočetajući gen RdRp i N) ima nisku procentualnu vrijednost Ct (< 20 Ct) u veličini od 87,6%, a vrijednost Ct gena ORF1a/b u istraživanju Sansure Biotech 2019. - Analiza nCoV pokazala nizkij Ct. Kao što je prikazano na slici 1, Abbottov test SARS-CoV-2 (kombinuje RdRp i N gene) imao je najniži postotak Ct vrijednosti (< 20 Ct) od 87,6%, dok je Ct vrijednost gena ORF1a/b u Sansureu Studija Biotech 2019 – Analiza nCoV pokazala je nizak Ct. Procenat vrednosti (< 20 Ct) iznosio je 50,3%, a procenat visokih vrednosti Ct (36–40 Ct) iznosio je 3,2%. Procenat vrednosti (< 20 Ct) bio je 50,3%, a procenat visokih vrednosti Ct (36-40 Ct) 3,2%.Abbott SARS-CoV-2 B test zabilježio je Ct vrijednosti iznad 30. S druge strane, na BGI SARS-CoV-2 testu gen ORF1a/b je imao visoku vrijednost Ct (> 36 Ct), postotak je iznosio 4% (slika 1). S druge strane, na BGI SARS-CoV-2 testu gen ORF1a/b je imao visoku vrijednost Ct (> 36 Ct), postotak je iznosio 4% (slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gena ORF1a/b ima visoku vrijednost Ct (> 36 Ct), postotak kojeg čini 4% (ris. 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b je imao visoku Ct vrijednost (>36 Ct), čiji je postotak iznosio 4% (Sl. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中,ORF1a/b 基因具有高Ct 值 (> 36 Ct)）的百分%比丛〼 S druge strane, u detekciji BGI SARS-CoV-2, postotak gena ORF1a/b sa visokom vrijednošću Ct (>36 Ct) je 4% (Slika 1). S druge strane, u analizi BGI SARS-CoV-2 procenta gena ORF1a/b s visokim vrijednostima Ct (>36 Ct) iznosio je 4% (ris. 1). S druge strane, u BGI SARS-CoV-2 analizi, postotak gena ORF1a/b sa visokim vrijednostima Ct (>36 Ct) iznosio je 4% (slika 1).
U ovoj studiji uzeli smo 164 uzorka nazofarinksa. Za sve vrste testova, izolacija i amplifikacija RNK je izvršena korištenjem metoda i kompleta preporučenih od strane odgovarajućih proizvođača.
Ova studija je pokazala da Abbottov test na SARS-CoV-2 ima iste performanse detekcije kao i CRS, sa 100% pozitivnom, negativnom i ukupnom podudarnošću. Cohenov kapa sporazum je 1.00, što ukazuje na potpuno slaganje sa CRS-om. Slična studija Univerziteta Washington u SAD-u pokazala je da je ukupna osjetljivost i specifičnost Abbott testa na SARS-CoV-2 bila 93% odnosno 100%, u poređenju sa laboratorijski određenim testom (LDA) CDC-a. . 11. Abbottov sistem detekcije SARS-CoV-2 zasniva se na istovremenoj kombinovanoj detekciji N i RdRp gena, budući da su oba gena osjetljivija, minimizirajući lažne negativne rezultate12. Studija u Beču, Austrija, takođe je pokazala da velike količine ekstrakcionog uzorka i zapremine eluenta za detekciju minimiziraju efekte razblaživanja i povećavaju efikasnost detekcije13. Dakle, Abbottov savršeni spoj za SARS-CoV-2 test može biti povezan sa sistemom za detekciju platforme koji istovremeno detektuje kombinatorne gene, ekstrahuje veliki broj uzoraka (0,5 ml) i koristi veliku količinu eluenta (40 µl).
Naši rezultati su također pokazali da je učinak detekcije Daan genetskog testa bio gotovo isti kao kod CRS-a. Ovo je u skladu sa studijom14 sprovedenom na Univerzitetu Anhui u Huainanu, Kina, i tvrdnjom proizvođača o 100% pozitivnom slaganju. Unatoč izvještajima o konzistentnim rezultatima, jedan uzorak je bio lažno negativan nakon ponovnog testiranja istog eluata, ali je bio pozitivan u Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019 testovima. Ovo sugerira da može postojati varijabilnost u rezultatima u različitim tipovima testova. Ipak, u studiji sprovedenoj u Kini15, rezultat Daan Gene testa bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u poređenju sa njihovim laboratorijskim referentnim testom. Ipak, u studiji sprovedenoj u Kini15, rezultat Daan Gene testa bio je značajno drugačiji (p < 0,05) u poređenju sa njihovim laboratorijskim referentnim testom. Ovo nije manje, u istraživanju, sprovedenom u Kitae15, rezultat analize Daan Genea značajno se razlikuje (p < 0,05) od njihove laboratorijske etalonske analize. Međutim, u studiji u Kini15, rezultat analize Daan Genea bio je značajno drugačiji (p < 0,05) od njihove laboratorijske referentne analize.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Međutim, u istraživanju, sprovedenom u Kitae15, rezultati genetičkog testa Daan značajno su se razlikovali (p < 0,05) u odnosu na njegov etalonski laboratorijski test. Međutim, u jednoj studiji u Kini15, rezultati Daanovog genetskog testa bili su značajno drugačiji (p < 0,05) u poređenju sa njegovim referentnim laboratorijskim testom.Ovo odstupanje može biti posljedica osjetljivosti referentnog testa za otkrivanje SARS-CoV-2, a daljnje studije mogu biti važne za utvrđivanje uzroka.
Pored toga, naša studija je procijenila uporedni učinak SARS-CoV-2 BGI testa sa CRS-om, pokazujući odlično pozitivno procentualno slaganje (PPA = 97,9%), negativno procentualno slaganje (NPA = 100%) i ukupni postotak slaganja prema spolu ( OPA). ). = 98,8%). Cohenove Kappa vrijednosti su pokazale dobro slaganje (K = 0,975). Studije u Holandiji16 i Kini15 pokazale su konzistentne rezultate. SARS-CoV-2 BGI test je test detekcije jednog gena (ORF1a/b) koji koristi 10 µl eluata za amplificiranje/detekciju. Uprkos dobrom statističkom slaganju sa našim referentnim rezultatima, u analizi su propuštena dva pozitivna uzorka (1,22%) od ukupnog uzorka. Ovo može imati velike kliničke implikacije na dinamiku prijenosa i na nivou pacijenta i na nivou zajednice.
Još jedna komparativna analiza uključena u ovu studiju je Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) test; ukupan procenat utakmica je bio 96,3%. Jačina slaganja je također određena Cohenovom kapa vrijednošću, koja je iznosila 0,925, što ukazuje na potpuno slaganje sa CRS-om. Opet, naši rezultati su identični studijama sprovedenim na Univerzitetu Central South u Čangši, Kina, i na Odeljenju kliničke laboratorije Narodne bolnice Liuzhou, grad Liuzhou, Kina17. Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemar test) je pokazao da je rezultat Sansure Biotech testa imao statistički značajnu razliku u odnosu na CRS (p < 0,005). Iako je zabilježena gore navedena dobra statistička podudarnost, hi-kvadrat test (MacNemar test) je pokazao da je rezultat Sansure Biotech testa imao statistički značajnu razliku u odnosu na CRS (p < 0,005). Bez obzira na to, što je zafiksirano ukazano na više visoke statističke ocene, kriterijum hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je rezultat analize Sansure Biotech ima statistički značajne razlike u odnosu na CRS (p < 0,005). Iako je zabilježeno dobro statističko slaganje iznad, hi-kvadrat test (McNemar test) je pokazao da rezultat Sansure Biotech testa ima statistički značajnu razliku u odnosu na CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验 (MacNemar 检验)）表明, Sansure Biotech, CR相比具有统计学显着差异 (p < 0,005)。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， san biotech与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。) Bez obzira na više odmerene statističke ocene, kriterijum hi-kvadrata (kriterij Maknemara) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između analize Sansure Biotech i CRS. Uprkos dobrom statističkom slaganju gore navedenom, hi-kvadrat test (McNemar test) pokazao je statistički značajnu razliku (p < 0,005) između Sansure Biotech testa i CRS.Utvrđeno je da su šest uzoraka (3,66%) lažno negativni u poređenju sa CRS (dodatna tabela 1); ovo je veoma važno, posebno s obzirom na dinamiku prenošenja virusa. Gore navedeni podaci također podržavaju ovu nisku stopu otkrivanja15.
U ovoj studiji, vrijednosti Ct su određene za svaki test i odgovarajuću platformu, s najnižom srednjom vrijednošću Ct zabilježenom u Abbott testu SARS-CoV-2. Ovaj rezultat može biti povezan sa Abbottovim simultanim kombinovanim sistemom genetskog testiranja za otkrivanje SARS-CoV-2. Stoga, prema slici 1, 87,6% rezultata Abbott SARS-CoV-2 imalo je Ct vrijednosti ispod 20. Samo mali broj rezultata uzorka (12,4%) bio je u rasponu od 20-30. Ct vrijednosti iznad 30 nisu zabilježene. Osim što Abbott koristi format za panel genetsko testiranje SARS-CoV-2, ovaj rezultat može biti povezan s donjom granicom detekcije (32,5 kopija RNK/mL)18, koja je tri puta niža od donje granice kompanije od 100 kopija RNA /mL. ml)19.
Ova studija ima neka ograničenja: prvo, nemamo standardne/referentne metode [kao što su virusno opterećenje ili drugi laboratorijski testovi (LDA)] zbog nedostatka resursa. Drugo, svi uzorci korišteni u ovoj studiji bili su nazofaringealni brisevi, dok rezultati nisu bili primjenjivi na druge tipove uzoraka, i treće, veličina našeg uzorka je bila mala.
Ova studija upoređivala je učinak četiri rRT-PCR testa na SARS-CoV-2 koristeći uzorke nazofarinksa. Svi testovi detekcije imali su skoro uporedive performanse, sa izuzetkom Sansure Biotech testa. Osim toga, niska stopa pozitivnosti je identifikovana u Sansure Biotech testu u poređenju sa CRS (p < 0,05). Osim toga, niska stopa pozitivnosti je identifikovana u Sansure Biotech testu u poređenju sa CRS (p < 0,05). Osim toga, u testu Sansure Biotech pokazao je nizak postotak pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05). Osim toga, Sansure Biotech test je pokazao nizak postotak pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05).此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外, 与CRS 相比, Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Osim toga, analiza Sansure Biotech-a ima više niskih nivoa pozitivnih rezultata u odnosu na CRS (p < 0,05). Pored toga, Sansure Biotech test je imao nižu stopu pozitivnosti u poređenju sa CRS (p < 0,05).Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) analiza PPA, NPA i ukupnog slaganja premašila je 93,5% sa Cohen Kappa jačinom slaganja od 0,925. Konačno, Sansure Biotech Assay (RUO) treba dalju validaciju za upotrebu u Etiopiji, a potrebno je razmotriti dodatna istraživanja kako bi se procijenile tvrdnje pojedinačnih proizvođača.
Dizajn komparativnog istraživanja sproveden je u četiri zdravstvene ustanove u Adis Abebi, bolnici Eka Kotebe, Centru za lečenje crkve Milenijum, Memorijalnoj bolnici Zewooditu i Specijalističkoj bolnici za tuberkulozu Svetog Petra. Podaci su prikupljeni od 1. do 31. decembra 2020. Medicinske ustanove za ovu studiju su namjerno odabrane na osnovu njihovog velikog broja slučajeva i dostupnosti većih centara za liječenje u gradu. Slično tome, instrumenti, uključujući instrumente za PCR u realnom vremenu ABI 7500 i Abbott m2000, odabrani su prema preporukama proizvođača reagensa NAAT, a za ovu studiju odabrana su četiri kompleta za PCR detekciju, jer je većina laboratorija u Etiopiji koristila najmanje najmanje njih četiri. Genski test, Abbott SARS-CoV-2 test, Sansure Biotech test i SARS-CoV-2 BGI test obavljen tokom studije).
Testiranje na SARS-CoV-2 obavljeno je od 1. do 30. decembra 2020. pomoću 3 ml virusnog transportnog medija (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) od pojedinaca pod istragom za COVID-19 upućenih EPHI. Nazofaringealne uzorke su sakupili obučeni sakupljači uzoraka i poslani u EPHI u trostrukim pakovanjima. Prije izolacije nukleinske kiseline, svakom uzorku se dodjeljuje jedinstveni identifikacioni broj. Ekstrakcija se vrši iz svakog uzorka odmah po dolasku koristeći ručne i automatske metode ekstrakcije. Dakle, za automatsku ekstrakciju Abbott m2000, 1,3 ml (uključujući 0,8 ml mrtve zapremine i 0,5 ml ulazne zapremine ekstrakcije) uzorka je ekstrahovano iz svakog uzorka i propušteno kroz Abbott DNK sistem za pripremu uzoraka (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, SAD). ) Serija od 96 [92 uzorka, dvije kontrole za otkrivanje i dvije kontrole bez šablona (NTC)] uključena je u cjelokupni proces (preuzimanje i otkrivanje) dvije runde SARS-CoV-2 (EUA) u realnom vremenu. rudarstvo. Slično, za ručno izvlačenje koristite iste uzorke (za automatsko izdvajanje i otkrivanje). Dakle, tokom cijelog procesa, 140 µl uzoraka je alikvotirano i ekstrahirano korištenjem QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Njemačka) u serijama od 24 (uključujući 20 uzoraka, dvije kontrole analize i dva NTC) u devet rundi. Ručno ekstrahovani eluati su pojačani i detektovani korišćenjem ABI 7500 termalnog ciklusa koristeći SARS-CoV-2 BGI test, Daan Gene test i Sansure Biotech test.
Automatska izolacija i pročišćavanje virusne RNK SARS-CoV-2 slijedi princip magnetske kuglice koristeći Abbott DNK reagens za pripremu uzoraka. Inaktivacija uzoraka i solubilizacija virusnih čestica vrši se pomoću deterdženta koji sadrži gvanidin izotiocijanat za denaturaciju proteina i inaktivaciju RNKaze. RNK se zatim odvaja od proteina razdvajanjem čvrste faze upotrebom silicijum dioksida, tj. gvanidinijum soli i alkalni pH pufera za lizu pospešuju vezivanje nukleinskih kiselina za silicijum dioksid (SiO2). Korak ispiranja uklanja preostale proteine ​​i ostatke kako bi se proizvela bistra otopina. Transparentna RNK se izoluje iz mikročestica na bazi silicijum-dioksida pomoću magnetnog polja instrumenta20,21. S druge strane, ručna izolacija i pročišćavanje RNK se vrši metodom spin kolone uz korištenje centrifugiranja umjesto magnetnog postolja i odvajanja mikročestica od eluenta.
Abbottov test detekcije SARS-CoV-2 u realnom vremenu (Abbott Molecular, Inc.) izveden je prema uputstvima proizvođača, koji su dobili EUA19,22 od SZO i FDA. U ovom protokolu, inaktivacija uzorka prije ekstrakcije izvedena je u vodenom kupatilu na 56 °C u trajanju od 30 minuta. Nakon inaktivacije virusa, ekstrakcija nukleinske kiseline izvedena je na Abbott m2000 SP instrumentu od 0,5 ml VTM koristeći Abbott m2000 sistem za pripremu uzoraka DNK. prema proizvođaču. Amplifikacija i detekcija su izvedeni pomoću Abbott m2000 RT-PCR instrumenta, a dvostruka detekcija je izvršena za RdRp i N gene. ROX) i VIC P (zaštićena boja) za ciljanje i detekciju internih kontrola, omogućavajući istovremeno otkrivanje oba proizvoda za pojačavanje 19 .
Metoda detekcije amplifikacije ovog kompleta zasnovana je na RT-PCR tehnologiji u jednom koraku. ORF1a/b i N geni su odabrani kao konzervirani regioni pomoću Daan Gene Technology za detekciju amplifikacije ciljnog regiona. Specifični prajmeri i fluorescentne sonde (N genske sonde označene FAM, ORF1a/b sonde označene VIC) dizajnirane su za otkrivanje SARS-CoV-2 RNK u uzorcima. Konačni eluent i master mješavine pripremljene su dodavanjem 5 µl eluenta na 20 µl glavne mješavine do konačnog volumena od 25 µl. Amplifikacija i detekcija su obavljeni istovremeno na ABI 750024 PCR instrumentu u realnom vremenu.
Geni ORF1a/b i N otkriveni su pomoću Sansure Biotech nCoV-2019 dijagnostičkog kompleta za nukleinsku kiselinu (fluorescentna PCR detekcija). Pripremite specifične sonde za svaki ciljni gen odabirom FAM kanala za ORF1a/b regiju i ROX kanala za N gen. Ovom kompletu za analizu dodaju se eluens i reagensi za glavnu mješavinu na sljedeći način: pripremite 30 µl reagensa glavne mješavine i 20 µl eluiranog uzorka za detekciju/amplifikaciju. PCR u realnom vremenu ABI 750025 je korišten za amplifikaciju/detekciju.
SARS-CoV-2 BGI test je fluorescentni rRT-PCR komplet u realnom vremenu za dijagnozu COVID-19. Ciljna regija se nalazi u ORF1a/b regiji genoma SARS-CoV-2, što je metoda detekcije jednog gena. Osim toga, ljudski gen za održavanje kućanstva β-aktin je interno regulirani ciljni gen. Glavna mješavina se priprema miješanjem 20 µl reagensa master mixa i 10 µl ekstrahovanog uzorka RNK u ploči s bunarima26. Za amplifikaciju i detekciju korišćen je fluorescentni kvantitativni PCR instrument ABI 7500 u realnom vremenu. Sva amplifikacija nukleinske kiseline, uslovi rada PCR-a za svaki test i interpretacija rezultata izvedeni su prema uputstvima odgovarajućeg proizvođača (tabela 3).
U ovoj komparativnoj analizi nismo koristili referentnu standardnu ​​metodu za određivanje postotka slaganja (pozitivnog, negativnog i ukupnog) i drugih parametara poređenja za četiri analize. Svako poređenje testa je rađeno sa CRS, u ovoj studiji CRS je postavljen po pravilu „bilo koji pozitivan“ i rezultat je određen, a ne jednim testom, koristili smo najmanje dva podudarna rezultata testa. Osim toga, u slučaju prijenosa COVID-19, lažno negativni rezultati su opasniji od lažno pozitivnih. Stoga, da bismo što preciznije rekli „pozitivno“ iz rezultata CRS, najmanje dva testa moraju biti pozitivna, što znači da će barem jedan pozitivan rezultat vjerovatno doći iz EUA testa. Dakle, od četiri rezultata testa, dva ili više rezultata testa koji daju isti rezultat smatraju se istinito pozitivnim ili negativnim18,27.
Podaci su prikupljeni korištenjem strukturiranih obrazaca za ekstrakciju podataka, unos i analiza podataka izvršeni su pomoću statističkog softvera Excel i SPSS verzije 23.0 za deskriptivnu statistiku. Analizirani su pozitivni, negativni i ukupni postotak slaganja, a Kappa skor je korišten za određivanje stepena slaganja svake metode sa CRS. Kappa vrijednosti se tumače na sljedeći način: 0,01 do 0,20 za blagi dogovor, 0,21 do 0,40 za opći slaganje, 0,41-0,60 za umjereno slaganje, 0,61-0,80 za veći dogovor i 0,81-0,99 za potpuno slaganje28.
Etičko odobrenje dobijeno je od Univerziteta u Adis Abebi, a sve eksperimentalne protokole za ovu studiju odobrio je Odbor za naučnu etiku Etiopskog instituta za javno zdravlje. Referentni broj za EPHI Etičku licencu je EPHI/IRB-279-2020. Sve metode su primijenjene u skladu s preporukama i odredbama Etiopskih nacionalnih sveobuhvatnih smjernica za liječenje COVID-19. Pored toga, dobijen je pismeni informirani pristanak od svih učesnika studije prije učešća u studiji.
Svi podaci dobijeni ili analizirani u ovoj studiji uključeni su u ovaj objavljeni članak. Podaci koji podržavaju rezultate ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Svjetska zdravstvena organizacija. Preporuke za strategije laboratorijskog testiranja na COVID-19: Privremeni vodič, 21. mart 2020. br. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (SZO, 2020.).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u Hitnoj pomoći: All-in u praksi. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Pametna dijagnoza COVID-19 u Hitnoj pomoći: All-in u praksi.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnoj službi: sve u praksi.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Inteligentna dijagnoza COVID-19 u hitnim odeljenjima: end-to-end integracija u praksi. Ekspert velečasni Respire. lijek. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa. Mitchell, SL & St George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell, SL i St. George, K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa.Mitchell SL i St. George K. Evaluacija COVID19 ID NOW EUA testa. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
SZO. Laboratorijsko otkrivanje korona virusne bolesti 2019 (COVID-19) kod sumnje na bolest kod ljudi. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (pristupljeno 15. avgusta 2020.) (SZO, 2020.).
Udugama, B. et al. Dijagnoza COVID-19: bolesti i alati za testiranje. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Osnivanje Koledža patologa istočne, centralne i južne Afrike – Regionalne škole za patologiju Bliskog istoka i Južne Afrike. Afrika. J. Lab. lijek. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopski institut za javno zdravstvo, Federalno ministarstvo zdravstva. Privremena nacionalna strategija i smjernice za laboratorijsku dijagnostiku COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (pristupljeno 12. avgusta 2020.) (EPHI, 2020.).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Lažno negativni testovi na izazove i implikacije infekcije SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Lažno negativni testovi na izazove i implikacije infekcije SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi na infekcije SARS-CoV-2 i njihove posljedice.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Lažno negativni testovi na provokaciju i uticaj infekcije SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Respiratorna prevencija i strategije upravljanja, vakcinacija i dalje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: Respiratorna prevencija i strategije upravljanja, vakcinacija i dalje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ložno-pozitivne i ložno-otporne slučajeve COVID-19: respiratorna prevencija i strategije liječenja, vakcinacija i daljnje perspektive. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: respiratorna prevencija i strategije liječenja, vakcinacija i put naprijed.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Lažno pozitivni i lažno negativni slučajevi COVID-19: strategije za respiratornu prevenciju i liječenje, vakcinaciju i put naprijed. Ekspert velečasni Respire. lijek. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Videti drvo, ali izgubiti šumu. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Dijagnoza COVID-19 u hitnoj pomoći: Videti drvo, ali izgubiti šumu.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. COVID-19 Dijagnoza u Hitnoj pomoći: Vidi drvo, izgubi šumu.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Dijagnoza COVID-19 u hitnim sobama: Nije dovoljno šume za drveće. pojavi se. lijek. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validacija i validacija analitičkih i kliničkih performansi Abbott RealTime SARS-CoV-2 testa. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Poređenje pet setova prajmera iz različitih regiona genoma COVID-19 za otkrivanje virusne infekcije konvencionalnim RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Poređenje pet setova prajmera iz različitih regiona genoma COVID-19 za detekciju virusne infekcije konvencionalnim RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Poređenje pet setova prajmera iz različitih regiona COVID-19 genoma za detekciju virusne infekcije konvencionalnim RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Poređenje 5 različitih genetskih regiona COVID-19 za otkrivanje virusne infekcije konvencionalnim RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Poređenje pet setova prajmera iz različitih regija genoma COVID-19 za otkrivanje virusne infekcije konvencionalnim RT-PCR.Iran. J. Microbiology. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Preliminarni rezultati nacionalnog programa eksterne procjene kvaliteta za otkrivanje sekvenci genoma SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analitička evaluacija efikasnosti pet RT-PCR kompleta za teški akutni respiratorni sindrom Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorija. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Procjena sedam komercijalno dostupnih kompleta za detekciju SARS-CoV-2 RNK u Kini na osnovu lančane reakcije polimeraze (PCR) u realnom vremenu. klinički. Hemijski. laboratorija. lijek. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Poređenje sedam komercijalnih RT-PCR dijagnostičkih kompleta za COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Poređenje dijagnostičkih performansi dva PCR kompleta za detekciju SARS-CoV-2 nukleinskih kiselina. J. Clinical. laboratorija. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, itd. Komparativna studija četiri SARS-CoV-2 platforme za testiranje amplifikacije nukleinske kiseline (NAAT) pokazala je da je učinak ID NOW značajno smanjen u zavisnosti od pacijenta i tipa uzorka. dijagnoza. mikrobiologija. Zaraziti. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbottova molekula. Abbottov paket za analizu SARS-CoV-2 u realnom vremenu. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Od 10. avgusta 2020.) (2020.).
Klein, S. et al. Izolacija SARS-CoV-2 RNK pomoću magnetnih kuglica za brzo otkrivanje velikih razmjera pomoću RT-qPCR i RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).