Faktori interferencije u PCR reakcijama

Tokom PCR reakcije često se susreću neki interferirajući faktori.
Zbog vrlo visoke osjetljivosti PCR-a, kontaminacija se smatra jednim od najvažnijih faktora koji utiču na rezultate PCR-a i može dati lažno pozitivne rezultate.
Jednako su kritični različiti izvori koji dovode do lažno negativnih rezultata. Ako je jedan ili više bitnih dijelova PCR smjese ili sama reakcija amplifikacije inhibirana ili ometana, dijagnostički test može biti ometen. To može dovesti do smanjene efikasnosti, pa čak i lažno negativnih rezultata.
Osim inhibicije, može doći do gubitka integriteta ciljne nukleinske kiseline zbog uslova transporta i/ili skladištenja prije pripreme uzorka. Konkretno, visoke temperature ili neadekvatno skladištenje mogu dovesti do oštećenja ćelija i nukleinskih kiselina. Fiksacija ćelija i tkiva i ugradnja parafina su dobro poznati uzroci fragmentacije DNK i uporni problem (vidi slike 1 i 2). U tim slučajevima, čak ni optimalna izolacija i pročišćavanje neće pomoći.

Slika 1 | Utjecaj imobilizacije na integritet DNK
Elektroforeza u agaroznom gelu pokazala je da je kvalitet DNK izolirane iz parafinskih rezova obdukcija značajno varirao. U ekstraktima je bila prisutna DNK različite prosječne dužine fragmenata u zavisnosti od metode fiksacije. DNK je sačuvana samo kada je fiksirana u nativnim smrznutim uzorcima i u puferiranom neutralnom formalinu. Upotreba jako kiselog Bouin fiksatora ili nepuferovanog formalina koji sadrži mravlju kiselinu rezultirala je značajnim gubitkom DNK. Preostala frakcija je vrlo fragmentirana.
Na lijevoj strani, dužina fragmenata je izražena u parovima kilobaza (kbp)

Slika 2 | Gubitak integriteta meta nukleinske kiseline
(a) Razmak od 3′-5′ na oba lanca rezultirat će prekidom u ciljnoj DNK. sinteza DNK će se i dalje odvijati na malom fragmentu. Međutim, ako na fragmentu DNK nedostaje mjesto žarenja prajmera, dolazi samo do linearne amplifikacije. U najpovoljnijem slučaju, fragmenti mogu ponovo zasićeni jedni drugima, ali će prinosi biti mali i ispod nivoa detekcije.
(b) Gubitak baza, uglavnom zbog depurinacije i formiranja timidin dimera, dovodi do smanjenja broja H-veza i smanjenja Tm. Tokom produžene faze zagrijavanja, prajmeri će se istopiti od matrične DNK i neće se žariti čak ni pod manje strogim uslovima.
(c) Susedne baze timina formiraju TT dimer.
Još jedan uobičajeni problem koji se često javlja u molekularnoj dijagnostici je manje od optimalnog oslobađanja ciljnih nukleinskih kiselina u usporedbi s ekstrakcijom fenol-kloroformom. U ekstremnim slučajevima, ovo može biti povezano s lažno negativnim. Mnogo se vremena može uštedjeti lizom ključanja ili enzimskom digestijom staničnih ostataka, ali ova metoda često rezultira niskom PCR osjetljivošću zbog nedovoljnog oslobađanja nukleinske kiseline.

Inhibicija aktivnosti polimeraze tokom amplifikacije

Općenito, inhibicija se koristi kao koncept kontejnera za opisivanje svih faktora koji dovode do suboptimalnih PCR rezultata. U strogo biohemijskom smislu, inhibicija je ograničena na aktivnost enzima, tj. smanjuje ili sprečava konverziju supstrat-produkt kroz interakciju sa aktivnim mestom DNK polimeraze ili njenim kofaktorom (npr. Mg2+ za Taq DNK polimerazu).
Komponente u uzorku ili različiti puferi i ekstrakti koji sadrže reagense mogu direktno inhibirati enzim ili uhvatiti njegove kofaktore (npr. EDTA), čime inaktiviraju polimerazu i zauzvrat dovode do smanjenih ili lažno negativnih PCR rezultata.
Međutim, mnoge interakcije između komponenti reakcije i nukleinskih kiselina koje sadrže cilj su također označene kao 'PCR inhibitori'. Jednom kada se integritet ćelije naruši izolacijom i nukleinska kiselina se oslobodi, može doći do interakcije između uzorka i njegovog okolnog rastvora i čvrste faze. Na primjer, 'čistači' mogu vezati jednolančanu ili dvolančanu DNK kroz nekovalentne interakcije i ometati izolaciju i pročišćavanje smanjujući broj meta koje na kraju dospiju do PCR reakcijske posude.
Općenito, PCR inhibitori su prisutni u većini tjelesnih tekućina i reagenasa koji se koriste za kliničke dijagnostičke testove (urea u urinu, hemoglobin i heparin u krvi), dodacima prehrani (organske komponente, glikogen, masti, Ca2+ joni) i komponentama u okolišu (fenoli, teški metali)

Preovlađujući PCR inhibitori mogu se naći u bakterijama i eukariotskim ćelijama, neciljanoj DNK, DNK-vezujućim makromolekulama tkivnih matrica i laboratorijskoj opremi kao što su rukavice i plastika. Prečišćavanje nukleinskih kiselina tokom ili nakon ekstrakcije je poželjna metoda za uklanjanje PCR inhibitora.
Danas različita automatizirana oprema za ekstrakciju može zamijeniti mnoge ručne protokole, ali 100% oporavak i/ili pročišćavanje ciljeva nikada nije postignut. Potencijalni inhibitori mogu još uvijek biti prisutni u pročišćenim nukleinskim kiselinama ili su možda već stupili na snagu. Postoje različite strategije za smanjenje uticaja inhibitora. Izbor odgovarajuće polimeraze može imati značajan uticaj na aktivnost inhibitora. Druge dokazane metode za smanjenje inhibicije PCR-a su povećanje koncentracije polimeraze ili primjena aditiva kao što je BSA.
Inhibicija PCR reakcija može se demonstrirati upotrebom interne kontrole kvaliteta procesa (IPC).
Mora se paziti da se iz izolata nukleinske kiseline temeljnim ispiranjem uklone svi reagensi i druge otopine u kompletu za ekstrakciju, kao što su etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol i fenol. Ovisno o njihovoj koncentraciji, mogu aktivirati ili inhibirati PCR.