Umetni faktori u PCR reakcijama

Tijekom PCR reakcije često se susreću neki interferirani faktori.
Zbog vrlo velike osjetljivosti PCR-a zagađenje se smatra jednim od najvažnijih faktora koji utječu na rezultate PCR-a i može proizvesti lažne pozitivne rezultate.
Jednako kritični su različiti izvori koji dovode do lažnih negativnih rezultata. Ako su jedan ili više bitnih dijelova PCR smjese ili same reakcije pojačanja, inhibiraju se ili ometaju, dijagnostički test može se ometati. To može dovesti do smanjene efikasnosti i čak lažnih negativnih rezultata.
Pored inhibicije, gubitak ciljanog integriteta nukleinske kiseline može se pojaviti zbog otpreme i / ili uloga za pohranu prije pripreme uzoraka. Konkretno, visoke temperature ili neadekvatno skladištenje mogu dovesti do oštećenja ćelija i nukleinskih kiselina. Fiksacija ćelije i tkiva i ugradnja parafina su poznati uzroci fragmentacije DNK i trajnog problema (vidi slike 1 i 2). U tim se slučajevima čak i optimalna izolacija i pročišćavanje neće pomoći.

Slika 1 | Uticaj imobilizacije na integritet DNK
Agarozna gel elektroforeza pokazala je da se kvaliteta DNK izolira iz parafinskih dijelova obdukova. DNK različitih prosečnih fragmentnih duljina bila je prisutna u ekstraktima ovisno o načinu fiksacije. DNK je sačuvan samo kada je fiksiran u matičnim zamrznutim uzorcima i u puferiranom neutralnom formalinu. Upotreba snažno kiselog bouina fiksativa ili nepunjena, formalna formalina koja sadrži kiselinu koja sadrži značajan gubitak DNK. Preostali frakcija je vrlo fragmentirana.
Na lijevoj strani, dužina fragmenata izražava se u kilobaznim parovima (kBP)

Slika 2 | Gubitak integriteta nukleinskih ciljeva kiseline
(a) 3'-5 'jaz na oba naleta rezultirat će prekidom u ciljnom DNK. Sinteza DNK i dalje će se pojaviti na malom fragmentu. Međutim, ako se na fragmentu DNK nedostaje primer za primer, dolazi do linearnog pojačala. U najpovoljnijem slučaju, fragmenti mogu se međusobno reprotirati, ali prinosi će biti mali i ispod nivoa otkrivanja.
(b) Gubitak osnova, uglavnom zbog formiranja dependiranja i timidina, dovodi do smanjenja broja H-veza i smanjenja TM-a. Tokom izdužene faze zagrijavanja, pramci će se rastopiti od matrice DNK i neće biti ujednačene ni pod manje strogim uvjetima.
(c) Susjedne baze timinata formiraju TT dimer.
Drugi zajednički problem koji se često javlja u molekularnom dijagnostiku je manje optimalno oslobađanje ciljnih nukleinskih kiselina u odnosu na ekstrakciju fenol-kloroform. U ekstremnim slučajevima to se može povezati s lažnim negativima. Mnogo vremena se može spasiti ključalom lizom ili enzimskom probavom ćelijskih krhotina, ali ova metoda često rezultira niskom PCR osjetljivošću zbog nedovoljnog oslobađanja nukleinskog kiselina.

Inhibicija aktivnosti polimeraze tokom pojačanja

Općenito, inhibicija se koristi kao kontejnerski koncept za opisivanje svih faktora koji dovode do suboptimalnih PCR rezultata. U strogo biohemijskom smislu, inhibicija je ograničena na aktivnost enzima, tj. Smanjuje ili smanjuje pretvorbu podloge - kroz interakciju s aktivnim mjestom DNK polimeraze ili njenog kofaktora (npr. MG2 + za TAQ DNK polimerazu).
Komponente u uzorku ili raznim puferima i ekstraktima koji sadrže reagense mogu izravno inhibirati enzim ili zarobiti njegove kofaktore (npr. EDTA), na taj način inaktiviraju polimerazu i zauzvrat vodeći do smanjenja ili lažnih negativnih rezultata PCR-a.
Međutim, mnoge interakcije između komponenti reakcije i nukleinskih kiselina koje sadrže cilja također su označene kao "PCR inhibitori". Jednom kada se integritet ćelije poremeti izolacijom, a nukleinska kiselina se oslobađa, mogu se pojaviti interakcije između uzorka i njenog okolnog rješenja i solidne faze. Na primjer, "Scangents" mogu obvezati jedno-nasutirano DNK kroz ne-kovalentne interakcije i ometati izolaciju i pročišćavanje smanjenjem broja ciljeva koji na kraju dođu do PCR reakcijskog plovila.
Općenito, inhibitori PCR-a prisutni su u većini tjelesnih tekućina i reagenata koji se koriste za kliničke dijagnostičke testove (urea u urinu, hemoglobinu i heparinu u krvi), dodaci prehrani (organske komponente, glikogen, masti, ca2 + ioni) i komponente u okruženju (fenoli, teški metali)

Prevlatniji PCR inhibitori mogu se naći u bakterijama i eukariotskim ćelijama, ne-ciljanim DNK, makromolekulama za obvezujući makromolekule tkiva i laboratorijske opreme kao što su rukavice i plastike. Pročišćavanje nukleinskih kiselina tokom ili nakon vađenja je preferirana metoda za uklanjanje PCR inhibitora.
Danas, razna automatizirana oprema za vađenje mogu zamijeniti mnoge ručne protokole, ali 100% oporavak i / ili pročišćavanje ciljeva nikada nije postignut. Potencijalni inhibitori još uvijek mogu biti prisutni u pročišćenim nukleinskim kiselinama ili su možda već učili. Postoje različite strategije za smanjenje utjecaja inhibitora. Izbor odgovarajuće polimeraze može imati značajan utjecaj na aktivnost inhibitora. Ostale dokazane metode za smanjenje inhibicije PCR povećavaju koncentraciju polimeraze ili primjenjuju aditive poput BSA-e.
Inhibicija PCR reakcija može se pokazati upotrebom interne kontrole kvaliteta procesa (IPC).
Mora se odvesti da ukloni sve reagense i druga rješenja u kompletu za vađenje, poput etanola, EDTA, CETAB, licl, gusfn, SDS-a, izopropanola i fenola, iz nukleinske kiseline izolira se temeljitom korakom za pranje. Ovisno o njihovoj koncentraciji, oni mogu aktivirati ili inhibirati PCR.