Faktori interferencije u PCR reakcijama

Tokom PCR reakcije često se susreću neki interferirajući faktori.
Zbog vrlo visoke osjetljivosti PCR-a, kontaminacija se smatra jednim od najvažnijih faktora koji utiču na rezultate PCR-a i može dati lažno pozitivne rezultate.
Podjednako su važni i različiti izvori koji dovode do lažno negativnih rezultata. Ako su jedan ili više bitnih dijelova PCR smjese ili same reakcije amplifikacije inhibirani ili ometani, dijagnostički test može biti otežan. To može dovesti do smanjene efikasnosti, pa čak i lažno negativnih rezultata.
Pored inhibicije, gubitak integriteta ciljne nukleinske kiseline može se dogoditi zbog uslova transporta i/ili skladištenja prije pripreme uzorka. Posebno, visoke temperature ili neadekvatno skladištenje mogu dovesti do oštećenja ćelija i nukleinskih kiselina. Fiksacija ćelija i tkiva i ugradnja u parafin su dobro poznati uzroci fragmentacije DNK i stalni problem (vidi slike 1 i 2). U ovim slučajevima, čak ni optimalna izolacija i pročišćavanje neće pomoći.

Slika 1 | Učinak imobilizacije na integritet DNK
Elektroforeza na agaroznom gelu pokazala je da se kvalitet DNK izolovane iz parafinskih presjeka autopsija znatno razlikuje. DNK različitih prosječnih dužina fragmenata bila je prisutna u ekstraktima, ovisno o metodi fiksacije. DNK je sačuvana samo kada je fiksirana u nativnim smrznutim uzorcima i u puferiranom neutralnom formalinu. Upotreba jako kiselog Bouin fiksativa ili nepuferiranog formalina koji sadrži mravlju kiselinu rezultirala je značajnim gubitkom DNK. Preostala frakcija je visoko fragmentirana.
S lijeve strane, dužina fragmenata je izražena u kilobaznim parovima (kbp)

Slika 2 | Gubitak integriteta meta nukleinskih kiselina
(a) Razmak od 3′-5′ na oba lanca rezultirat će prekidom u ciljnoj DNK. Sinteza DNK će se i dalje odvijati na malom fragmentu. Međutim, ako na fragmentu DNK nedostaje mjesto vezivanja primera, dolazi samo do linearne amplifikacije. U najpovoljnijem slučaju, fragmenti se mogu ponovo zasititi, ali će prinosi biti mali i ispod nivoa detekcije.
(b) Gubitak baza, uglavnom zbog depurinacije i formiranja timidinskog dimera, dovodi do smanjenja broja H-veza i smanjenja Tm. Tokom produžene faze zagrijavanja, prajmeri će se otopiti od matrice DNK i neće se vezati čak ni pod manje strogim uslovima.
(c) Susjedne timinske baze formiraju TT dimer.
Još jedan uobičajeni problem koji se često javlja u molekularnoj dijagnostici je manje optimalno oslobađanje ciljnih nukleinskih kiselina u poređenju sa fenol-hloroform ekstrakcijom. U ekstremnim slučajevima, ovo može biti povezano sa lažno negativnim rezultatima. Mnogo vremena se može uštedjeti lizom kuhanjem ili enzimskom digestijom ćelijskih ostataka, ali ova metoda često rezultira niskom osjetljivošću PCR-a zbog nedovoljnog oslobađanja nukleinskih kiselina.

Inhibicija aktivnosti polimeraze tokom amplifikacije

Općenito, inhibicija se koristi kao kontejnerski koncept za opisivanje svih faktora koji dovode do suboptimalnih PCR rezultata. U strogo biohemijskom smislu, inhibicija je ograničena na aktivnost enzima, tj. smanjuje ili sprječava konverziju supstrata u produkt putem interakcije s aktivnim mjestom DNK polimeraze ili njenog kofaktora (npr. Mg2+ za Taq DNK polimerazu).
Komponente u uzorku ili različiti puferi i ekstrakti koji sadrže reagense mogu direktno inhibirati enzim ili vezati njegove kofaktore (npr. EDTA), čime se inaktivira polimeraza i zauzvrat dovodi do smanjenih ili lažno negativnih PCR rezultata.
Međutim, mnoge interakcije između reakcijskih komponenti i nukleinskih kiselina koje sadrže mete također se nazivaju "PCR inhibitori". Nakon što se integritet ćelije poremeti izolacijom i nukleinska kiselina se oslobodi, mogu doći do interakcija između uzorka i okolnog rastvora i čvrste faze. Na primjer, "hvatači" mogu vezati jednolančanu ili dvolančanu DNK putem nekovalentnih interakcija i ometati izolaciju i pročišćavanje smanjenjem broja meta koje na kraju dospiju u PCR reakcijsku posudu.
Općenito, PCR inhibitori su prisutni u većini tjelesnih tekućina i reagensa koji se koriste za kliničke dijagnostičke testove (urea u urinu, hemoglobin i heparin u krvi), dodacima prehrani (organske komponente, glikogen, masti, Ca2+ ioni) i komponentama u okolišu (fenoli, teški metali).

Češći PCR inhibitori mogu se naći u bakterijama i eukariotskim ćelijama, neciljnoj DNK, makromolekulama tkivnih matrica koje se vežu za DNK i laboratorijskoj opremi kao što su rukavice i plastika. Pročišćavanje nukleinskih kiselina tokom ili nakon ekstrakcije je preferirana metoda za uklanjanje PCR inhibitora.
Danas, razna automatizirana oprema za ekstrakciju može zamijeniti mnoge ručne protokole, ali 100% oporavak i/ili pročišćavanje ciljeva nikada nije postignuto. Potencijalni inhibitori mogu još uvijek biti prisutni u pročišćenim nukleinskim kiselinama ili su možda već stupili na snagu. Postoje različite strategije za smanjenje utjecaja inhibitora. Izbor odgovarajuće polimeraze može imati značajan utjecaj na aktivnost inhibitora. Druge dokazane metode za smanjenje inhibicije PCR-a su povećanje koncentracije polimeraze ili primjena aditiva kao što je BSA.
Inhibicija PCR reakcija može se dokazati korištenjem interne kontrole kvalitete procesa (IPC).
Potrebno je voditi računa da se svi reagensi i ostali rastvori iz kompleta za ekstrakciju, kao što su etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol i fenol, uklone iz izolata nukleinske kiseline temeljnim pranjem. Ovisno o njihovoj koncentraciji, oni mogu aktivirati ili inhibirati PCR.