Testiranje metilacije DNK u kombinaciji sa pametnim telefonima za rano otkrivanje tumora i leukemije sa tačnošću od 90,0%!

Rano otkrivanje raka na osnovu tečne biopsije je novi pravac otkrivanja i dijagnosticiranja raka koji je posljednjih godina predložio Američki nacionalni institut za rak, s ciljem otkrivanja ranog raka ili čak prekanceroznih lezija. Široko se koristi kao novi biomarker za ranu dijagnozu različitih maligniteta, uključujući rak pluća, gastrointestinalne tumore, gliome i ginekološke tumore.

Pojava platformi za identifikaciju biomarkera metilacijskog pejzaža (Methylscape) ima potencijal da značajno poboljša postojeći rani skrining za rak, dovodeći pacijente u najraniju izlječivu fazu.

Nedavno su istraživači razvili jednostavnu i direktnu platformu za detekciju metilacijskog pejzaža zasnovanu na zlatnim nanočesticama ukrašenim cisteaminom (Cyst/AuNP) u kombinaciji s biosenzorom baziranim na pametnom telefonu, koja omogućava brzi rani skrining širokog spektra tumora. Rani skrining na leukemiju može se obaviti u roku od 15 minuta nakon ekstrakcije DNK iz uzorka krvi, s tačnošću od 90,0%. Naslov članka je Brza detekcija DNK raka u ljudskoj krvi korištenjem AuNP-ova prekrivenih cisteaminom i pametnog telefona s omogućenim mašinskim učenjem.

Slika 1. Jednostavna i brza platforma za detekciju raka putem komponenti Cyst/AuNPs može se ostvariti u dva jednostavna koraka.

Ovo je prikazano na Slici 1. Prvo je vodeni rastvor korišten za rastvaranje fragmenata DNK. Cyst/AuNP su zatim dodani u miješani rastvor. Normalna i maligna DNK imaju različita svojstva metilacije, što rezultira fragmentima DNK s različitim obrascima samosklapanja. Normalna DNK se labavo agregira i na kraju agregira Cyst/AuNP, što rezultira crvenom prirodom Cyst/AuNP, tako da se promjena boje iz crvene u ljubičastu može vidjeti golim okom. Nasuprot tome, jedinstveni profil metilacije DNK raka dovodi do proizvodnje većih klastera fragmenata DNK.

Slike ploča sa 96 jažica snimljene su kamerom pametnog telefona. DNK raka mjerena je pametnim telefonom opremljenim mašinskim učenjem u poređenju sa metodama zasnovanim na spektroskopiji.

Pregled za rak u stvarnim uzorcima krvi

Kako bi proširili korisnost platforme za detekciju, istraživači su primijenili senzor koji je uspješno razlikovao normalnu i kancerogenu DNK u stvarnim uzorcima krvi. Obrasci metilacije na CpG mjestima epigenetički regulišu ekspresiju gena. Kod gotovo svih vrsta raka, uočene su naizmjenične promjene u metilaciji DNK, a time i u ekspresiji gena koji potiču tumorogenezu.

Kao model za druge vrste raka povezane s metilacijom DNK, istraživači su koristili uzorke krvi pacijenata s leukemijom i zdravih kontrolnih osoba kako bi istražili učinkovitost metilacijskog pejzaža u diferencijaciji leukemijskih karcinoma. Ovaj biomarker metilacijskog pejzaža ne samo da nadmašuje postojeće metode brzog skrininga leukemije, već i pokazuje izvodljivost proširenja na rano otkrivanje širokog spektra karcinoma korištenjem ovog jednostavnog i direktnog testa.

Analizirana je DNK iz uzoraka krvi 31 pacijenta s leukemijom i 12 zdravih osoba. Kao što je prikazano na dijagramu na Slici 2a, relativna apsorbancija uzoraka raka (ΔA650/525) bila je niža od apsorbancije DNK iz normalnih uzoraka. To je uglavnom bilo zbog pojačane hidrofobnosti koja je dovela do guste agregacije DNK raka, što je spriječilo agregaciju Cyst/AuNP. Kao rezultat toga, ove nanočestice su bile potpuno dispergirane u vanjskim slojevima agregata raka, što je rezultiralo različitom disperzijom Cyst/AuNP adsorbiranih na normalnim i agregatima DNK raka. ROC krivulje su zatim generirane promjenom praga od minimalne vrijednosti ΔA650/525 do maksimalne vrijednosti.

Slika 2.(a) Relativne vrijednosti apsorbancije rastvora cista/AuNPs koje pokazuju prisustvo normalne (plava) i kancerogene (crvena) DNK pod optimiziranim uslovima

(DA650/525) box plot dijagrama; (b) ROC analiza i evaluacija dijagnostičkih testova. (c) Matrica konfuzije za dijagnozu normalnih i onkoloških pacijenata. (d) Osjetljivost, specifičnost, pozitivna prediktivna vrijednost (PPV), negativna prediktivna vrijednost (NPV) i tačnost razvijene metode.

Kao što je prikazano na Slici 2b, površina ispod ROC krive (AUC = 0,9274) dobijena za razvijeni senzor pokazala je visoku osjetljivost i specifičnost. Kao što se može vidjeti iz box plot-a, najniža tačka koja predstavlja normalnu DNK grupu nije dobro odvojena od najviše tačke koja predstavlja DNK grupu raka; stoga je korištena logistička regresija za razlikovanje između normalne i kancerozne grupe. S obzirom na skup nezavisnih varijabli, procjenjuje se vjerovatnoća nastanka događaja, kao što je rak ili normalna grupa. Zavisna varijabla se kreće između 0 i 1. Rezultat je stoga vjerovatnoća. Vjerovatnoću identifikacije raka (P) odredili smo na osnovu ΔA650/525 na sljedeći način.

gdje je b=5,3533, w1=-6,965. Za klasifikaciju uzorka, vjerovatnoća manja od 0,5 ukazuje na normalan uzorak, dok vjerovatnoća od 0,5 ili veća ukazuje na uzorak raka. Slika 2c prikazuje matricu konfuzije generiranu unakrsnom validacijom "leave-it-alone", koja je korištena za validaciju stabilnosti metode klasifikacije. Slika 2d sumira evaluaciju dijagnostičkog testa metode, uključujući osjetljivost, specifičnost, pozitivnu prediktivnu vrijednost (PPV) i negativnu prediktivnu vrijednost (NPV).

Biosenzori bazirani na pametnim telefonima

Kako bi dodatno pojednostavili testiranje uzoraka bez upotrebe spektrofotometara, istraživači su koristili vještačku inteligenciju (AI) za interpretaciju boje rastvora i razlikovanje normalnih od kancerogenih osoba. S obzirom na to, kompjuterski vid je korišten za prevođenje boje rastvora Cyst/AuNPs u normalnu DNK (ljubičasta) ili kancerogenu DNK (crvena) koristeći slike ploča sa 96 jažica snimljenih kamerom mobilnog telefona. Vještačka inteligencija može smanjiti troškove i poboljšati dostupnost u interpretaciji boje rastvora nanočestica, i to bez upotrebe bilo kakvog optičkog hardvera ili dodatne opreme za pametne telefone. Konačno, dva modela mašinskog učenja, uključujući Random Forest (RF) i Support Vector Machine (SVM), obučena su za konstrukciju modela. Oba RF i SVM modela su ispravno klasifikovala uzorke kao pozitivne i negativne sa tačnošću od 90,0%. To ukazuje na to da je upotreba vještačke inteligencije u biosenzorima zasnovanim na mobilnim telefonima sasvim moguća.

Slika 3.(a) Ciljana klasa rastvora snimljena tokom pripreme uzorka za korak akvizicije slike. (b) Primjer slike snimljene tokom koraka akvizicije slike. (c) Intenzitet boje rastvora ciste/AuNPs u svakom bunarčiću ploče sa 96 bunarčića izdvojene iz slike (b).

Koristeći Cyst/AuNP, istraživači su uspješno razvili jednostavnu platformu za detekciju metilacijskog pejzaža i senzor sposoban za razlikovanje normalne DNK od DNK raka pri korištenju uzoraka stvarne krvi za skrining leukemije. Razvijeni senzor je pokazao da je DNK ekstrahirana iz uzoraka stvarne krvi bila u stanju brzo i isplativo detektirati male količine DNK raka (3nM) kod pacijenata s leukemijom za 15 minuta, te je pokazala tačnost od 95,3%. Kako bi se dodatno pojednostavilo testiranje uzoraka eliminiranjem potrebe za spektrofotometrom, korišteno je mašinsko učenje za tumačenje boje otopine i razlikovanje normalnih i kancerogenih osoba pomoću fotografije mobilnog telefona, a tačnost je također bila postignuta na 90,0%.

Referenca: DOI: 10.1039/d2ra05725e